2024-10-07-中国兽医协会-动物病原微生物宏基因组高通量测序技术规范专家共识（2024版）_13页_393kb

宏基因组高通量测序技术在动物病原微生物检测中的专家共识（2024版）

摘要

宏基因组高通量测序技术作为一种新兴的微生物检测工具，能直接从临床样品中鉴定所有病原微生物，无需依赖培养或特异性扩增，广泛应用于动物病原检测、未知病原诊断和流行病学调查等场景。该共识从实验室建设、实验操作、生物信息学分析、结果判定和质量控制等方面提出了规范性要求，旨在统一行业内认知并指导临床应用。

关键词

宏基因组高通量测序；动物病原微生物；实验室规范；生物信息学；质量控制

主要内容

1. 实验室建设要求

• 生物安全：实验室需具备BSL-2及以上资质，符合农业农村部监管。
• 结构布局：包括体系配制室、样品处理室、核酸提取室、文库制备室和测序室，设备需支持单向流动以最小化污染。
• 人员配置：要求专业背景包括分子生物学、微生物学、生物信息学和兽医临床经验。
• 测序平台：选择基于测序样品数量、长度和成本（包括二代NGS和三代TGS）决定，NGS精度高但读长短，TGS读长长但成本高。

2. 实验操作规范

• 样品采集与制备：采集应从感染部位取样，避免污染，并标明关键信息；储存需低温，采样后尽快送检。
• 核酸提取：推荐使用自动化或验证过的提取试剂，针对DNA、RNA或共提取。
• 文库制备：根据样品类型选择DNA、RNA或共文库方法，监控文库质量（如片段大小、浓度）。
• 上机测序：使用测序仪说明书操作，确认碱基质量（Q30或Q7）和数据量达标。

3. 生物信息学分析流程

• 数据库：建议基础使用公共数据库（如NCBI），并自建兽源病原数据库，定期更新以覆盖全部微生物。
• 数据分析：包括数据预处理（过滤低质量序列）、去宿主序列、物种鉴定（至少到种属水平），使用软件如Kraken2和BLAST。

4. 结果判定标准

• 阈值与归一化：检测基于Reads per million（RPM）或相对丰度，建议阈值为至少3条序列且覆盖3个非重复区域。
• 综合判定：结合阴性对照、样品信息和临床症状制定标准，避免假阳性和假阴性。

5. 质量控制措施

• 数据质量：二代测序要求Q30≥90%，数据量≥10M；三代要求Q10≥80%，数据量≥1Gb。
• 性能验证：通过质控品验证方法性能，包括符合率、检出限和重复性。
• 对照实验：每批加入阴性对照（如洁净细胞或异源核酸）监控气溶胶污染，阳性质控品包含6类病原覆盖全面。

6. 测序报告指南

• 内容：包括物种信息、样品描述、临床数据、序列数、质控数据和注释。
• 解读：结合临床症状和流行病史解释结果，非孤立依赖测序数据。

小结

宏基因组高通量测序在动物病原检测中优势明显，但技术流程复杂，对专业技能要求高。该共识旨在提供统一规范，以促进兽医检测行业的标准化和应用发展。